淫羊藿是我国传统的补益中药香港最新伦理片，其主要化学因素包括黄酮、木脂素、生物碱及多糖，此外还含有极少的蒸发油、棕榈酸和硬脂酸等[1]。黄酮偏激繁衍物是淫羊藿化学因素的弘大构成部分，体表里药理学推行标明，这一类化合物均存在壮阳作用、雌激素样作用、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、心血管及神经系统保护作用等平淡的药理活性[2]。

淫羊藿苷是淫羊藿主要的黄酮苷类化合物之一[3-4]，其可被东说念主肠说念菌代谢轰动为淫羊藿次苷Ⅱ，淫羊藿次苷Ⅱ是大鼠ig予以淫羊藿苷后接收入血的主要因素，是淫羊藿苷发达药效的物资基础[5-6]。此外，包括朝藿定A、B、C在内的含有8位异戊烯基的黄酮苷类化合物在肠说念菌的作用下也不错轰动成次级苷，即淫羊藿次苷Ⅱ，进而接收入血发达药效作用[7]。

体外药理学斟酌发现，淫羊藿次苷Ⅱ是高接管性5型磷酸二酯酶（PDE5）扼制剂，对PDE5A1扼制作用的IC50值为160 nmol/L，扼制强度是其他5型磷酸二酯酶的10倍[8-9]。但淫羊藿次苷Ⅱ体内推行数据领会，该化合物口服后受首关效应影响，在大鼠体内的生物利费用仅为4.1%[10]。

进一步的代谢斟酌发现，葡萄糖醛酸化反映是淫羊藿次苷Ⅱ在大鼠体内主要的生物轰动进程，3位与7位双葡萄糖醛酸代谢产品与7位单葡萄糖醛酸代谢产品是大鼠血中检测到的主要代谢产品。在大鼠胆汁和尿中7位单葡萄糖醛酸代谢产品是检测到的主要产品，而淫羊藿素为在大鼠粪便中主要检测到的代谢产品[11]。由尿苷二磷酸葡萄糖醛酸调动酶（UDP-glucuronosyltransferase，UGT）介导的葡萄糖醛酸化反映是药物在体内弘大的Ⅱ相代谢反映，参与近40%临床药物的代谢[12]。在东说念主体内，UGT1A与UGT2B亚家眷参与经皮肤、呼吸说念以及口腔投入体内的外源性化合物的葡萄糖醛酸化代谢，使之易于排出体外，对机体起到保护作用[13]。关于存在光显首关效应的药物而言，代谢作为可能是影响其生物利费用的主要原因之一，而UGT代谢酶扼制剂的存在大约增多药物的接收，放慢药物的取销，进而对其生物利费用产生一定进程的改善。

因此，本斟酌通过体外推行技艺，以淫羊藿次苷Ⅱ为底物，分歧检会槲皮素、山柰酚、桔皮素、柚皮素、水飞蓟素、胡椒碱、草质素、甘草查尔酮A及异银杏双黄酮对淫羊藿次苷Ⅱ在不同种属肝微粒体及东说念主肠微粒体中葡萄糖醛酸化反映的扼制作用，并对具有较强扼制作用的扼制剂（半数扼制浓度IC50≤10 μmol/L）在东说念主肝微粒体中的扼制机制进行系统的斟酌，测定IC50及扼制常数（Ki）值，为升迁淫羊藿次苷Ⅱ生物利费用提供有价值的参考信息。

1 材料 1.1 药品与试剂

淫羊藿次苷Ⅱ（批号150627）、山柰酚（批号150414）、槲皮素（批号150302）、柚皮素（批号140330）、桔皮素（批号140912）、水飞蓟素（批号141102）、胡椒碱（批号150329）、草质素（批号141217）、甘草查尔酮A（批号150724）、异银杏双黄酮（批号140316），质地分数均大于98%，购于成都普菲德生物技艺有限公司。

淫羊藿次苷Ⅱ-7-O-葡萄糖醛酸代谢产品，推行室制备，制备设施见“2.3”项；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA，批号069K7017V）、聚乙二醇十六烷基醚（批号055K0045），购于好意思国Sigma-Aldrich公司；氯化镁（MgCl2，批号20100110）、盐酸（分析纯，批号20150818），购于天津市科密洋化学试剂有限公司；Tris碱（批号527K073），购于北京索莱宝科技有限公司；甲酸（色谱纯，批号A0326132），购于好意思国Acros organics公司。

SD大鼠肝微粒体（批号BDVH）、恒河猴肝微粒体（批号ZDD）、袖珍猪肝微粒体（批号RUIB）、东说念主肝微粒体（批号LPS）、东说念主肠微粒体（批号UGU），均购于上海瑞德肝脏疾病斟酌有限公司；甲醇和乙腈（色谱纯），购于好意思国Fisher Scientific公司；二甲基亚砜（DMSO，批号14010920），购于好意思国TEDIA公司；去离子水，好处。

1.2 仪器

SHIMADZU超快速高效液相色谱仪（UFLC）、LC-30AD高压泵、SPD-20A紫外/可见光检测器、CBM-20A系统铁心器、DGU-20A真空在线脱气机、SIL-30AC自动进样器、CTO-30A柱温箱、LabSolutions 5.81数据惩处系统，日本SHIMADZU公司；Thermo-Shaker MS-100恒温混匀仪、HERAEUS X1R低温高速离情绪，好意思国Thermo Scientific公司；LAB DANCER S25涡旋回荡器，德国IKA公司；BSA224S分析天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；Milli-Q超纯水制备系统，好意思国MILLIPORE公司；IMS-20制冰机，江苏省常熟市雪科电器有限公司。

2 设施 2.1 主要溶液的配制

精密称取淫羊藿次苷Ⅱ适量，DMSO融解，配制成浓度为0.5 mmol/L的圭臬溶液；分歧精密称取山柰酚、槲皮素、柚皮素、桔皮素、水飞蓟素、胡椒碱、草质素、甘草查尔酮A、异银杏双黄酮适量，DMSO融解，配制成浓度为20 mmol/L的圭臬溶液，DMSO次序稀释，分歧取得浓度为2.0、0.2 mmol/L的圭臬溶液，保存于4 ℃雪柜待用。

2.2 UFLC色谱条目

SHIMADZU VP-ODS C18色谱柱（5 μm，150.0 mm×2.1 mm）；柱温40 ℃；流动相为乙腈（A）-0.2%甲酸水（B）；梯度洗脱要害：0～7.0 min，90%～10% B；7.0～8.0 min，10% B；8.0～9.0 min，10%～90% B；9.0～12.0 min，90% B；体积流量0.4 mL/min；检测波长270 nm；进样量5 μL。

2.3 淫羊藿次苷Ⅱ葡萄糖醛酸代谢产品的制备

采纳500 μmol/L淫羊藿次苷Ⅱ与卵白浓度为0.5 mg/mL的东说念主重组酶UGT1A1进行代谢产品制备。37 ℃孵育24 h，加入等体积乙腈拆开反映，离心移取上清液置旋转蒸发仪中畏俱有机溶剂。残留液通过SPE固相萃取柱（C18WAX，北京华谱新创科技有限公司）进行富集和接管性洗脱。

2.4 淫羊藿次苷Ⅱ的UGT扼制剂筛选

孵育体系包括：50 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH值为7.4）、5 mmol/L MgCl2、2 mmol/L UDPGA、1 mg/mL Brij 58。东说念主肝、肠微粒体卵白浓度分歧为0.03、0.10 mg/mL，淫羊藿次苷Ⅱ浓度分歧为2.5、5.0 μmol/L。大鼠和猴肝微粒体卵白浓度均为0.03 mg/mL，袖珍猪肝微粒体卵白浓度为0.2 mg/mL，淫羊藿次苷Ⅱ浓度均为5 μmol/L。

扼制剂槲皮素、山柰酚、桔皮素、柚皮素、水飞蓟素、胡椒碱、草质素、甘草查尔酮A及异银杏双黄酮浓度分歧为1、10、100 μmol/L，每个样品体积为200 μL，双样本，反映体系中DMSO水平铁心在1%。

孵育反映液在金属恒温震荡仪中预孵3 min后，加入UDPGA驱动反映，于37 ℃孵育20 min后加入200 μL冰乙腈拆开反映，立即涡旋混匀，4 ℃、14 000 r/min离心20 min，取上清液置UFLC检测。对照组不加扼制剂。

以淫羊藿次苷Ⅱ葡萄糖醛酸化反映代谢产品的生成速度反映孵育体系中UGT酶的活性，对照组UGT酶活性记为100%，样品组中淫羊藿次苷Ⅱ代谢产品的生成速度与对照组中代谢产品生成速度的百分比用以标志UGT酶的残余活性，计较公式如下：

代谢产品生成速度＝代谢产品浓度/孵育时辰/卵白浓度

残余活性百分比＝样品组代谢产品生成速度/对照组代谢产品生成速度

2.5 所选扼制剂IC50值的测定

孵育体系包括：东说念主肝微粒体卵白浓度为0.03 mg/mL，淫羊藿次苷Ⅱ浓度为2.5 μmol/L，山柰酚与槲皮素浓度均中式为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、3.0、6.0 μmol/L，甘草查尔酮A的浓度中式为0、1.0、1.4、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0 μmol/L，其余同“2.4”项下条目与操作。

2.6 所选扼制剂Ki值的测定

孵育体系包括：东说念主肝微粒体卵白浓度为0.03 mg/mL，淫羊藿次苷Ⅱ中式的浓度分歧为0.80、1.25、2.50、5.00 μmol/L，山柰酚与槲皮素的浓度均中式为0、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol/L，甘草查尔酮A的浓度中式0、1、2、3、5 μmol/L，其余同“2.4”项下条目与操作。

2.7 统计学分析

竞争性扼制见方程式1，夹杂性扼制见方程式2，式中的Km和Vmax分歧为米氏常数与最大反映速度，[I]是游离扼制剂的浓度，[S]是底物浓度，Ki为扼制常数。IC50应用Graphpad Prism 6.0软件中非线性回首分析计较而得。Ki频繁需要在反映体系中缱绻3～4个底物浓度以及4～5个包括0点在内的扼制剂浓度。扼制能源学类型通过Dixon作图法和Lineweaver-Burk作图法坚信，二次作图法计较Ki。

$v = {{{V_{\max }}\left[ S \right]} \over {{K_m}\left( {1 + \left[ I \right]/{K_i}} \right) + \left[ S \right]}}$ (1) $v = {{{V_{\max }}\left[ S \right]} \over {{K_m}\left( {1 + \left[ I \right]/{K_i}} \right) + \left[ S \right]\left( {1 + \left[ I \right]/{K_i}} \right)}}$ (2) 3 效率 3.1 扼制剂筛选效率

淫羊藿次苷Ⅱ在不同种属肝及东说念主肠微粒体中，主要葡萄糖醛酸代谢产品为淫羊藿次苷Ⅱ-7-O-葡萄糖醛酸代谢产品，东说念主肝微粒体中淫羊藿次苷Ⅱ偏激葡萄糖醛酸代谢产品UFLC检测色谱图见图 1。

在东说念主肝微粒体中，当扼制剂山柰酚和异银杏双黄酮浓度为1 μmol/L时，代谢酶残余活性分歧为58.9%和40.0%；当扼制剂山柰酚、槲皮素、草质素及甘草查尔酮A浓度为10 μmol/L时，代谢酶残余活性均为0。在东说念主肠微粒体中，当扼制剂槲皮素浓度为10 μmol/L时，代谢酶残余活性为0，效率见图 2。

在大鼠肝微粒体中，当扼制剂山柰酚和甘草查尔酮A浓度为10 μmol/L时，代谢酶残余活性分歧为18.2%、19.0%。在袖珍猪肝微粒体中，当扼制剂甘草查尔酮A浓度为1 μmol/L时，代谢酶残余活性为59.7%；当扼制剂槲皮素与草质素浓度为10 μmol/L时，代谢酶残余活性均为0，山柰酚和甘草查尔酮A组代谢酶残余活性分歧为20.6%、7.88%。在猴肝微粒体中，当扼制剂甘草查尔酮A和异银杏双黄酮浓度为1 μmol/L时，代谢酶残余活性分歧为48.9%、59.4%；当扼制剂槲皮素、草质素和甘草查尔酮A浓度为10 μmol/L时，代谢酶残余活性为0，山柰酚组代谢酶残余活性为25.5%，效率见图 3。

效率标明，在东说念主、大鼠、袖珍猪、猴肝微粒体及东说念主肠微粒体中，山柰酚、槲皮素、草质素及甘草查尔酮A均对淫羊藿次苷Ⅱ的葡萄糖醛酸化反映有较强的扼制作用。凭据推行效率，接管具有较强扼制作用的山柰酚、槲皮素和甘草查尔酮A，测定其对东说念主肝微粒体中淫羊藿次苷Ⅱ葡萄糖醛酸化代谢扼制作用的IC50及Ki值。

3.2 IC50及Ki值测定效率

期骗不同浓度的扼制剂画图剂量相干性弧线，效率见图 4，非线性拟合求得扼制剂扼制作用的IC50值，效率见表 1。山柰酚、槲皮素及甘草查尔酮A对淫羊藿次苷Ⅱ在东说念主肝微粒体中的葡萄糖醛酸化反映均有较强进程的扼制作用，IC50值分歧为（1.01±0.26）、（4.65±0.51）、（5.34±1.00） µmol/L，山柰酚对东说念主肝微粒体的扼制作用略强于槲皮素及甘草查尔酮A。

表 1 扼制剂山柰酚、槲皮素与甘草查尔酮在东说念主肝微粒体中IC50与Ki值 Table 1 IC50 and Ki values of inhibitor kaempferol，quercetin，and licochalcone A in human liver microsomes

分歧以夹杂型、竞争性及非竞争性扼制模子拟合数据，效率见图 5至图 7，Dixon作图法及Lineweaver- Burk作图法标明，甘草查尔酮A大约竞争性扼制淫羊藿次苷Ⅱ在东说念主肝微粒体中的葡萄糖醛酸化反映，Ki值为0.18 µmol/L；槲皮素对淫羊藿次苷Ⅱ的葡萄糖醛酸化反映效能夹杂型扼制能源学模子，Ki值为0.23 µmol/L；山柰酚则合适非竞争型扼制能源学模子，Ki值为0.36 µmol/L，效率见表 1。

4 琢磨

本斟酌检会了山柰酚、槲皮素及甘草查尔酮A等9种化合物对东说念主、大鼠、袖珍猪、猴肝微粒体及东说念主肠微粒体中淫羊藿次苷Ⅱ葡萄糖醛酸化反映的影响。淫羊藿次苷Ⅱ属于黄酮类化合物，斟酌阐述，多种黄酮类化合物联结使用时，其中的一种或者几种黄酮类化合物会对另一黄酮化合物的能源学产生影响，使其生物利费用取得改善[14]，因此本推行扼制剂的接管主要以黄酮类化合物为主。

固然有文件报说念和推行室未发表数据标明上述9种化合物均是葡萄糖醛酸化反映的扼制剂[15-22]，但代谢酶扼制剂存在底物接管性，底物不同，扼制剂对代谢酶的扼制身手不同。代谢斟酌的推行动物模子接管关系到瞻望东说念主体内情况的准确性，故本斟酌率先对以上9种化合物在不同种属肝微粒体及东说念主肠微粒体中对淫羊藿次苷Ⅱ葡萄糖醛酸化反映的扼制身手进行初筛，对化合物的扼制身手进行评价，为进一步体内推行动物模子的接管提供参考信息。在东说念主、大鼠、袖珍猪、猴肝微粒体及东说念主肠微粒体中，山柰酚、槲皮素、草质素及甘草查尔酮A均对淫羊藿次苷Ⅱ的葡萄糖醛酸化反映有较强的扼制作用，IC50估算值均在10 μmol/L以下。草质素固然扼制身手强，但体外检修时发现，将草质素加入反映体系后会使体系情态发生光显变化，由于机制不解确，因此不将其纳入下一步扼制机制的斟酌限制内。

代谢性药物-药物互相作用是一把“双刃剑”香港最新伦理片，关于调整窗窄且通过单一酶代谢的药物而言，与其代谢酶扼制剂合用后一样会引起毒反作用增多，导致调整失败；但其也不错被积极期骗，越过是针对一些受首过效应影响权贵导致生物利费用偏低的药物而言，与代谢酶扼制剂合用青年物利费用会取得光显改善。Basu等[23]期骗姜黄素扼制霉酚酸的葡萄糖醛酸化反映，最终使霉酚酸的游离药物浓度升迁了6到9倍。本斟酌效指导会，山柰酚、槲皮素及甘草查尔酮A关于淫羊藿次苷Ⅱ在微粒体中的葡萄糖醛酸化反映均具有较强的扼制作用，在东说念主肝微粒体中的Ki值分歧达到了0.36、0.23、0.18 μmol/L。尽管体外效率标明3者均能裁减淫羊藿次苷Ⅱ的代谢速度，与淫羊藿次苷Ⅱ合用后有可能改善其生物利费用。但体外推行效率仅仅提供了一个接管的所在，并不行皆备反映体内确切切情况，因此，三者分歧与淫羊藿次苷Ⅱ合用后是否大约升迁其生物利费用还需进一步体内推行的考证。

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